TINCIONES UTILIZADAS EN MICROBIOLOGIA
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal
que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal
dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y
el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para
revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como
flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria,
etc.
Las células generalmente son tratadas para coagular el
protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la
fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con
sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la
fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios
estruturales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células
que han sido fijadas sobre un portaobjetos. tratando después éste con el agente
fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce
habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario,
hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que
las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse
con mucha precisión.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que
tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos
colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente
(cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares
cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos
ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal
violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente
(aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina,
la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales
lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las
gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro
Sudán.
Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la
célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por
sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el
ácido tánico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera
de ta1 modo que ahora sí podrá atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las
células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción.
EI azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las
células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que
oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la
presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del
material no celular no se tiñe.
La tinción negativa es el reverso del procedimiento de
tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el
medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La
sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células,
tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono
coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción
negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la
microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de
cápsulas alrededor de las células bacterianas.
Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben
usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas
de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen
estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente
artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan
artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que
no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura
realmente existente.
Examen de muestras al microscopio
Según la manipulación que efectuemos sobre la muestra a
observar y según los colorarntes que empleemos durante el proceso, podemos
hablar de diferentes modalidades de tinción.
Examen microscópico de las muestras
clínicas. Sin tinción
Es el montaje directo húmedo o examen en fresco: las
muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para
su observación. El material que es demasiado espeso para permitir la
diferenciación de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solución
salina fisiológica estéril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la
superficie del material.
Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos
móviles de parásitos intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de
otros parásitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc.
Examen microscópico de las muestras
clínicas levemente modificadas. Tinción simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las
estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul
Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver
elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes
proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los
polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
La tinta china o Nigrosina permite observar células
levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos
capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro
alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse
a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de
leucocitos.
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras
celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de
acuerdo con su propia constitución química.
Los ejemplos clásicos serían la tinción de GRAM o la de
Ziehl-Neelsen.
Examen de muestras al microscopio: la
tinción GRAM
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más
importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe
estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el
trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias
a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.)
se basan justamente en la tinción de GRAM
Descrita en forma breve, la secuencia de la tinción es la
siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se
lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 min y se lava de nuevo
con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con
Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar.
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés
Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la
tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y
gramnegativos (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que
ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos
distintos de bacterias).
Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma
distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes
celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al
organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared
celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la
célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de
peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la
pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula
Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente
de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de
fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de
la célula Gram-negativa es peptidoglicano.
Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que
indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas
bacterias, describiremos aquí con algún detalle la tinción de Gram y las
interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su funcionamiento.
Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen,
primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son
tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En
este estado, todas las células, tanto las Gram positivas como las
gramnegativos, están teñidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de
yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente
hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo
insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células Gram
positivas como las gramnegativos se encuentran en la misma situación.
Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla
de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal
violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se decoloran, mientras que
otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de
células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se
debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la
mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana
citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano
es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se
decolora. las células Gram positivas, a causa de sus paredes celulares más
espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al
disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros,
disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo
cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la
decoloración las células Gram positivas son todavía azules, pero las
gramnegativos son incoloras.
Para poner de manifiesto las células gramnegativos se
utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color
rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de
contraste las células gramnegativos son rojas, mientras que las Gram positivas
permanecen azules.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de
Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al
tratamiento con yodo. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células.
2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar
que pierdan la tinción las células Gram positivas. EI proceso de decoloración
debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener
resultados satisfactorios.
3) Cultivos más viejo de 24 horas puede perder su habilidad
de retener el complejo cristal violeta-yodo.
El carácter de Gram positivo no es siempre un fenómeno del
todo o nada. Algunos organismos son más Gram positivos que otros y algunos son
gram-variables, es decir, unas veces Gram positivos y otras gramnegativos.
Otras tinciones de uso habitual
RODAMINA-AURAMINA
Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las mico
bacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos
colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja
brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como
contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos
ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con
estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es
que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o
Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes
el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser
confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la
diferenciación morfológica.
NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico
ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de
naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del
pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como
colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo
y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el
ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la
tinción.
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de
bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, un gran
cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja
de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial
de hemocultivos positivos.
ZIEHL-NEELSEN (BAAR)
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias.
contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de
carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con
alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se
denominan ácido-alcohol resistente. Las mico bacterias como M. tuberculosis y
M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por
sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen
requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que
contiene ceras.Se ha desarrollado una coloración de ácido-alcohol
resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias
ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen ácidos-grasos de
unos 50 átomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no
ácido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla
ácido-alcohol estándar pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico
0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes
parciales o débiles.
El frotis se tiñe durante unos 5 min con Carbolfucsina
aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con un
3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg con Azul de Metileno
(color de contraste). Lavar y secar
BLANCO DE CALCOFLÚOR
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante
blanco de calco flúor aumentando considerablemente su visibilidad en los
tejidos y otras muestras. Según fue descrito por Hageage y Harrington, este
colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los
materiales clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los
elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos
laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los
organismos florecen con luz blanco-azulada o verde manzana, según la fuente
luminosa que se utilice.
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