La Escherichia coli es un
bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae
(bacterias entéricas) y existe como comensal en el intestino delgado de
humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patógenas
que provocan enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las características
que presentan sus factores de virulencia únicos, cada grupo provoca la
enfermedad por un mecanismo diferente.
Este
grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas:
·
E. coli enterotoxigénica
(ETEC)
·
E. coli enteropatógena
(EPEC)
·
E. coli enterohemorrágica
(EHEC)
·
E. coli enteroinvasiva
(EIEC)
·
E. coli enteroagregativa
(EAEC)
·
E. coli enteroadherente
difusa (DAEC)
Existen
otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas
anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el
consumo de agua y alimentos contaminados.
E. coli enterotoxigénica (ETEC)
Es reconocida como el agente
causal de la diarrea del viajero.
El microorganismo
es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolábil cuya secuencia,
antigenicidad y función es similar a la toxina del cólera, la otra toxina es
termoestable y es capaz de resistir temperaturas de ebullición hasta por 30
minutos. La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos como
vegetales frescos y agua.
E. coli enteropatógena ECEP
El microorganismo
produce dos proteínas, se adhiere a las células de la mucosa del intestino
delgado y a veces las penetra.Provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada
aunque en ocasiones puede ser crónica.
Las epidemias
causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua
contaminada y
productos cárnicos.
E. coli enteroinvasiva EIEC
Este
microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el género Shigella. Provoca la enfermedad diarrea disentérica invasiva al invadir las células
epiteliales de la
mucosa intestinal. Este microorganismo no utiliza la lactosa como fuente de carbono,
no descarboxilan la lisina, es inmóvil y anaerogenicos.
E. coli enterohemorrágica EHEC
Produce
verotoxina, la cual tiene muchas propiedades similares a la toxina shiga
producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1 y existen al menos
dos variantes antigénicas de la toxina. Se ha asociado con colitis hemorrágica,
una variedad grave de diarrea y con el síndrome urémico hemolítico.
La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar
o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades.
Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden
prevenirse mediante la cocción completa de la carne.
Fundamento
En la
fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato
de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren
presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente
de carbono.
Durante
la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde
brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos
microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde
brillante.
La
determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se
realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta
en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas
cuando son incubados a una temperatura de 44.4°C por un periodo de 24 a
48 h.
La
búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos
de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y
diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente
realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.
MEDIOS DE CULTIVO Y
DILUYENTES
Para análisis
de alimentos
·
1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua
peptonada 0.1 % o solución amortiguadora de fosfatos
·
2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de
agua peptonada 0.1 % o solución amortiguadora de fosfatos
·
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de
caldo lauril sulfato de sodio concentración sencilla o caldo lactosado
concentración sencilla con campana de Durham
·
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de
caldo bilis verde brillante con campana de Durham
·
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de
caldo EC o EC-MUG con campana de Durham
·
2 cajas Petri con agar para métodos
estándar
·
2 cajas Petri con agar Mac Conkey
·
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de
caldo RM-VP
·
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de
caldo triptona o agar SIM
·
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL
c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de Koser
Soluciones,
reactivos e indicadores
·
Frascos gotero con reactivo de Erlich o
Kovace
·
Frascos gotero con indicador rojo de
metiloe
·
Frascos gotero con reactivo alfa naftol
VP1e
·
Frascos gotero con solución de
hidróxido de potasio al 40 % VP2e
·
Colorantes para
tinción de GRAM
Material y equipo
·
Mechero
·
Propipeta
·
Gradilla
·
Balanza granataria
·
Stomachera
·
Bolsas para stomacher
·
Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4
watts. (366 nm)
·
Lentes de seguridad
·
Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodón
·
Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodón.
·
Pipetas Pasteur estériles
·
Asa bacteriológica
·
Portaobjetos
·
Microscopio óptico
·
Termómetro calibrado
·
Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C
·
Incubadora a 35° ± 2,0ºC
·
Horno para esterilizar material de vidrio a
160-180°C
·
Autoclave
Preparación de la
muestra
·
Moler 10.0 gramos de la muestra en un picador 2
veces o con cubiertos estériles y mezclar
·
Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada
al 0.1 %, licuar y dejar en reposo de 2-3 minutos.
·
Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua
peptonada al 0.1 %. En caso de trabajar
con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2° y 5 °C.
Prueba presuntiva
·
Añadir 1.0 mL de la dilución 10- 1 g/mL a cada uno
de 3 tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio.
·
Añadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3
g/mL a dos series de 3 tubos cada una con caldo lauril sulfato de sodio.
·
Incubar a 35-37°C durante 24-48 h.
·
Los tubos después de la incubación, se registrarán
como positivos si presentan crecimiento y producción de gas.
Prueba
confirmatoria de Escherichia coli.
·
Confirmar la presencia de Escherichia coli en
por lo menos el 10% de las pruebas con resultados positivos de coliformes
fecales; sembrar en placas de agar McConkey a partir de los tubos que
demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa.
·
Incubar las placas a 35 ± 0.5°C durante 24 ± 2 h.,
observar las colonias típicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo
opaco de precipitación de sales biliares.
·
Hacer tinción de Gram para observación de la
morfología de las bacterias. Seleccionar 1 o más colonias aisladas para
realizar pruebas IMViC.
Todos los cultivos que:
·
Fermenten la lactosa con producción de gas dentro
de las 48 h. a 35°C.
·
Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos no
esporulados.
·
Se obtenga las siguientes combinaciones para el IMVIC:
Biotipo 1(++--) o Biotipo 2 (-+--) son consideradas como Escherichia coli.
·
Calcular el NMP de E. coli basándose en la
proporción de los tubos positivos decaldo EC.
CÁLCULOS Y
EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Calcular la
densidad microbiana con base en el número más probable conforme al procedimiento
señalado en la tabla 1, (que se muestra a continuación y es utilizado para el
análisis de agua), para estimar la población de bacterias coliformes totales,
bacterias coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con las
diluciones empleadas.
Expresar en NMP/g
o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de usar volúmenes de 20
mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos,
utilizar las siguientes tablas:
Bibliografía
Técnicas para el Análisis
Microbiológico de Alimentos
No hay comentarios:
Publicar un comentario