INTRODUCCION
La salmonella es un microorganismo patógeno perteneciente
al grupo de Enterobacterias. Bacilo gram negativo, aerobio, no esporulado que
forman colonias típicas en medios selectivos sólidos
La Detección de Salmonella es la determinación de la
presencia o ausencia de estos microorganismos en una masa determinada de
producto
La NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, establece un
método general para la detección de salmonella en alimentos, esto en todo el
territorio mexicano, de manera obligatoria para todo aquel que requiera
realizar dicho método en productos nacionales y de importación para fines
oficiales.
Los microorganismos
del genero salmonella son considerados como patógenos cuando se encuentran en
los alimentos, y su control depende de alguna forma del método analítico que se
utilice para su detección.
Para diversos alimentos existen diferentes protocolos
para el aislamiento de Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en
principio y emplean las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento
selectivo, aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales,
identificación bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos.
FUNDAMENTO
La presente técnica para la detección de Salmonella en
alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos:
1.-
Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio
nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas
a una condición fisiológica estable.
2.- Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito
de incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos
presentes en la muestra.
3.- Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan
medios selectivos que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a
Salmonella y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas.
4.- Identificación bioquímica, este paso permite la
identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de
cultivos sospechosos falsos.
5.- Serotipificación, es una técnica serológica que
permite la identificación específica de un cultivo.
REACTIVOS Y
MATERIALES
Las sustancias químicas usadas para preparar los medios
de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico.
Reactivos
·
Medios de pre-enriquecimiento
·
Agua de peptona tamponada
·
Caldo lactosado
·
Caldo de enriquecimiento
·
Caldo selenito-cistina
·
Caldo tetrationato
·
Vassiliadis-Rappaport
Solución A
Ingredientes
·
Triptona - 5,0g
·
Cloruro de sodio - 8,0g
·
Fosfato de potasio dihidrogenado - 1,6g
·
Agua destilada - 1,0 litros
·
Disolver los componentes en agua por
calentamiento cercano a 70ºC.
Solución B
Ingredientes
·
Cloruro de magnesio hexahidratado - 400,0 g
·
Agua destilada - 1,0 litros
·
Disolver el cloruro de magnesio en agua.
·
Como esta sal es muy higroscópica es
conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente
recientemente abierto de tal modo que la concentración de la solución sea de
0,4 g/ml.
·
Conservar en frasco ámbar a temperatura
ambiente.
Solución C
Ingredientes
·
Oxalato de verde de malaquita - 0,4g
·
Agua destilada - 100,0 ml
·
Disolver el oxalato de verde de malaquita en
agua.
·
Conservar en frasco ámbar a temperatura
ambiente.
Medio completo
·
Caldo de soya tripticasa
·
Leche descremada reconstituida
·
Caldo soya tripticasa estéril adicionado con
sulfito de potasio
Medios de aislamiento
·
Agar verde brillante (VB)
·
Agar con sulfito de bismuto
·
Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
·
Agar para Salmonella y Shigella (SS)
·
Agar entérico Hektoen
Medios para pruebas
bioquímicas
·
Agar de tres azúcares y hierro (TSI)
·
Agar de hierro y lisina (LIA)
·
Agar nutritivo
·
Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y
Movilidad)
·
Agar citrato de Simmons
·
Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)
·
Caldo manitol
·
Caldo malonato
·
Caldo urea
·
Caldo de urea rápido
·
Caldo infusión cerebro corazón
Soluciones
·
Solución verde brillante al 0,1% (1:1000)
·
Solución de yodo-yoduro
·
Solución salina al 0,85%
·
Solución salina formalizada
·
Reactivo de Kovac
·
Solución de alfa-naftol al 5%
·
Solución de rojo de metilo
·
Solución de hidróxido de potasio al 40%
·
Solución de gelatinasa al 5%
Antisueros
·
Antisuero polivalente somático (O)
·
Antisuero polivalente flagelar (H)
·
Antisuero Vi
MATERIAL
·
Matraces Erlenmeyer de 500 ml
·
Recipientes de boca ancha, de capacidad
apropiada para contener las muestras simples y compuestas
·
Angulos de vidrio
·
Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas
·
Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100
mm
·
Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x
100 mm
·
Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 ml,
graduadas en 0,1 ml y protegidas con tapón de algodón
·
Pipetas de 1 ml, con graduaciones de 0,01 ml
·
Cajas de petri estériles de vidrio o
desechables
·
Rejillas para tubos de ensaye
·
Asa de platino o nicromel de aproximadamente
3 mm de diámetro
·
Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones
máximas de 0,4 unidades de pH para cambios de color
·
Todo el material que tenga contacto con las
muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:
§ Horno,
durante 2 horas a 170-175ºC o autoclave, durante 15 min como mínimo a 121ºC ±
1ºC
EQUIPO
§ Horno
para esterilizar que alcance los 180ºC
§ Incubadora
con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0,1ºC y termómetro
§ Autoclave
con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas
§ Baño
maría con termostato y termómetro
§ Balanza
granataria con sensibilidad de 0,1 g
§ Licuadora
de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos esterilizables
(vidrio o aluminio)
§ Mecheros
Bunsen o Fisher
§ Potenciómetro
PROCEDIMIENTO
1. Preparación de los alimentos para el
aislamiento de Salmonella
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de
la muestra analítica en una proporción de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad
puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. Se recomienda una
muestra de 25 g o más.
1.1 Procedimiento general para la preparación de muestras
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril
de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador peristáltico
(stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estéril
(generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si es
necesario durante un min. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un
recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min
a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el
pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con
hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el
recipiente enroscando suavemente la tapa.
Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. Continuar como se indica en 8.2.1.
1.2 Procedimiento específico para la preparación de
muestra según el producto
1.2.9 Carnes, sustitutos de carnes, derivados cárnicos,
sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y
hueso).
1.2.9.1 Productos procesados térmicamente y productos
secos. Se sigue el procedimiento señalado en 8.1.1 hasta la homogeneización. Si
la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse. Después de reposar,
mezclar bien y ajustar el pH como se indica en el procedimiento general. Para
emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las mismas proporciones y con
las mismas recomendaciones que para el coco. La cantidad de los mismos
dependerá en gran medida de la composición del alimento. Los detergentes no
serán necesarios en los productos glandulares en polvo. Incubar las muestras
como se indica en 8.1.1.
1.2.9.2 Productos crudos o altamente contaminados. Pesar
porciones de 25 g de producto en dos vasos para licuadora. Si la muestra es en
polvo o molida, el licuado puede omitirse y el producto puede pesarse
directamente en matraces Erlenmeyer estériles de 500 ml. Adicionar 225 ml de
caldo selenito cistina o 225 ml de caldo tetrationato (sin verde brillante) a
cada muestra analítica. Licuar por dos min y pasar asépticamente a matraces
Erlenmeyer de 500 ml. Dejar reposar y ajustar el pH
Adicionar 2,25 ml de
solución de verde brillante 0,1% y 4,5 ml de solución yodo-yoduro a la muestra
que se enriquecerá con caldo tetrationato. Homogeneizar e incubar. Continuar
como se indica en 8.2.1.
2. Aislamiento de Salmonella
2.1 Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces
con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir
respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo
tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en
sustitución del caldo tetrationato puede emplearse el medio
Vassiliadis-Rappaport.
2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos
fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo periodo. Estriar los productos que
fueron directamente enriquecidos en medios selectivos.
2.3 Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar
en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una
tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico
Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).
Efectuar el mismo procedimiento para el caldo
tetrationato.
Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC.
2.4 Examinar las placas para investigar la presencia de
colonias típicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes características:
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser
transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden
aparecer completamente negras.
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser
transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la
lactosa dan colonias amarillas.
Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o
sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente
negras.
Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de
Salmonella pueden ser cafés, grises o negras; con o sin brillo metálico.
Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente
negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro.
Si las placas no muestran colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar
24 h adicionales.
Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas.
Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son
rojas.
3.
Identificación bioquímica
3.1 Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada
medio selectivo, que se encuentren bien aisladas.
Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos
tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina
(LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo.
Incubar por 24 ± 2 h a 35ºC.
Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con
medios selectivos por si es necesario retomar más colonias.
3.2 Observar el crecimiento en los tubos y considerar
presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes
reacciones:
3.2.1 Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del
indicador debido a la fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se
observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no
fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se
observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de
ácido sulfihídrico.
3.2.2 Agar LIA, se observa intensificación del color
púrpura en todo el tubo por la descarboxilación de la lisina. Considerar
negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo
del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfihídrico en
este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.
3.2.3 Retener todos los cultivos que muestren las
reacciones características de Salmonella en los medios TSI y LIA para las
pruebas adicionales, indicadas en 8.3.3.
3.3 Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella
pero que presentan reacciones en LIA típicos, deben trabajarse como cultivos
presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar
S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa.
Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos
medios.
3.4 Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI
con reacciones típicas. Si el cultivo presenta reacciones atípicas en este
medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo
atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente.
3.5 Continuar la identificación bioquímica y serológica a
partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos
por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de ambos
medios de enriquecimiento.
3.6 Prueba de ureasa
3.6.1 Prueba de ureasa (convencional). Con una asa
estéril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de
medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de medio para
comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio
original. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC.
3.6.2 Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de
crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e
inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño de
agua.
Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva.
Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color del
medio).
4. IDENTIFICACIÓN SEROLÓGICA
4.1 Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella
(Antisuero polivalente O)
4.1.1 Colocar con una asa dos gotas separadas de solución
salina estéril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para
aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo
desarrollado en TSI.
4.1.2 Agregar a una de ellas una gota del antisuero
polivalente somático (O) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores
de madera.
4.1.3 Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia
adelante durante aproximadamente un min. Observar bajo buena iluminación sobre
un fondo oscuro.
4.1.4 Considerar cualquier grado de aglutinación como
positiva.
La prueba positiva resulta cuando se presenta
aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinación en la
gota que contiene el cultivo y la solución salina.
Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no
es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquímicas complementarias.
4.2 Cuando la aglutinación es positiva con el suero
polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los
diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuentes).
4.2.1 Si la
aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar
la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y
repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.
4.2.2 Si no se cuenta con los sueros grupoespecíficos,
solicitar la tipificación de la cepa al Laboratorio de Enterobacterias del
Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o al
Laboratorio Nacional de Salud Pública.
4.3 Si se requiere, practicar el ensayo de los antígenos
flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H).
4.3.1 Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar
infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a 35ºC hasta que se observe
crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseina
e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 ml
de solución salina formalizada a 5 ml del cultivo en caldo o al cultivo en agar
cerebro corazón (BHI).
4.3.2 Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar
(H) preparado en un tubo para serología (13 x 100 mm aproximadamente).
Adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. Preparar un control de solución
salina mezclando 0,5 ml de solución salina formalizada con 0,5 ml del antígeno
formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50ºC. Observar a
intervalos de 15 min por espacio de una h. Una prueba positiva es cuando se
observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe
interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre
aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba
inespecífica.
CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
1. Interpretación de reacciones bioquímicas y
serológicas.
CUADRO 1
Reacciones Reacciones
Interpretación
bioquímicas serológicas
Típica Antígeno
O, Cepas consideradas
Vi o H
positivo como Salmonella
Típica Todas
las
reacciones
negativas
Típica No
probada Puede ser
Salmonella
Reacciones Antígeno
O,
atípicas Vi o H
positivo
Reacciones Todas
las No debe ser
atípicas reacciones
considerada
negativas Salmonella
Nota: Ver apéndice informativo A.
2. Reacciones bioquímicas y serológicas de
Salmonella
CUADRO 2
Prueba o sustrato Positivo Negativo Reacción
Glucosa (TSI) amarillo rojo +
Lisina descarboxilasa púrpura amarillo +
(LIA)
H2S (TSI y LIA) negro no negro +
Ureasa rojo-púrpura no hay cambio -
de color
Caldo de lisina púrpura amarillo +
descarboxilasa
Caldo dulcitol amarillo
o gas no hay cambio +b
rojo de fenol de
color ni gas
Caldo KCN crecimiento no hay -
crecimiento
Caldo malonato azul no hay cambio -c
de color
Prueba de indol superficie
color superficie color -
violeta amarillo
Prueba del antígeno aglutinación no hay +
flagelar aglutinación
Prueba del antígeno aglutinación no hay +
somático aglutinación
Caldo lactosa amarillo
o gas no hay cambio -c
rojo fenol de color
ni gas
Caldo sacarosa amarillo
o gas no hay cambio -
rojo fenol de color
ni gas
Prueba Voges- de
rosa a rojo no hay cambio -
Proskauer de
color
Prueba rojo de metilo rojo
difuso amarillo difuso +
Citrato de Simmons crecimiento no hay v
color azul crecimiento, no
hay cambio
de color
a +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o más
negativas en 1 o 2 días; v, variable.
b La mayoría de los cultivos S. arizonae son negativos.
c La mayoría de los cultivos S. arizonae son positivos.
3. Informe de
resultados
Informar: presencia o ausencia de Salmonella en
__________ g o ____________ ml de muestra.
Bibliografía:
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