sábado, 2 de junio de 2012

Determinación de Salmonella



INTRODUCCION
La salmonella es un microorganismo patógeno perteneciente al grupo de Enterobacterias. Bacilo gram negativo, aerobio, no esporulado que forman colonias típicas en medios selectivos sólidos
La Detección de Salmonella es la determinación de la presencia o ausencia de estos microorganismos en una masa determinada de producto

La NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, establece un método general para la detección de salmonella en alimentos, esto en todo el territorio mexicano, de manera obligatoria para todo aquel que requiera realizar dicho método en productos nacionales y de importación para fines oficiales.

Los microorganismos del genero salmonella son considerados como patógenos cuando se encuentran en los alimentos, y su control depende de alguna forma del método analítico que se utilice para su detección.


Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el aislamiento de Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales, identificación bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos.


 FUNDAMENTO
La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos:
 
1.- Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas a una condición fisiológica estable.

2.- Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.

3.- Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas.

4.- Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

5.- Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo.

REACTIVOS Y MATERIALES

Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico.

Reactivos

·         Medios de pre-enriquecimiento

·         Agua de peptona tamponada

·         Caldo lactosado

·         Caldo de enriquecimiento

·         Caldo selenito-cistina

·         Caldo tetrationato

·         Vassiliadis-Rappaport


Solución A

Ingredientes

·         Triptona - 5,0g

·         Cloruro de sodio - 8,0g

·         Fosfato de potasio dihidrogenado - 1,6g

·         Agua destilada - 1,0 litros

·         Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70ºC.

Solución B

Ingredientes

·         Cloruro de magnesio hexahidratado - 400,0           g

·         Agua destilada - 1,0 litros

·         Disolver el cloruro de magnesio en agua.

·         Como esta sal es muy higroscópica es conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente abierto de tal modo que la concentración de la solución sea de 0,4 g/ml.

·         Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.

Solución C

Ingredientes

·         Oxalato de verde de malaquita - 0,4g

·         Agua destilada - 100,0 ml

·         Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua.

·         Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.

Medio completo

·         Caldo de soya tripticasa

·         Leche descremada reconstituida

·         Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio

Medios de aislamiento

·         Agar verde brillante (VB)

·         Agar con sulfito de bismuto

·         Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

·         Agar para Salmonella y Shigella (SS)

·         Agar entérico Hektoen

Medios para pruebas bioquímicas

·         Agar de tres azúcares y hierro (TSI)

·         Agar de hierro y lisina (LIA)

·         Agar nutritivo

·         Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad)

·         Agar citrato de Simmons

·         Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)

·         Caldo manitol

·         Caldo malonato

·         Caldo urea

·         Caldo de urea rápido

·         Caldo infusión cerebro corazón

 Soluciones

·         Solución verde brillante al 0,1% (1:1000)

·         Solución de yodo-yoduro

·         Solución salina al 0,85%

·         Solución salina formalizada

·         Reactivo de Kovac

·         Solución de alfa-naftol al 5%

·         Solución de rojo de metilo

·         Solución de hidróxido de potasio al 40%

·         Solución de gelatinasa al 5%

 Antisueros

·         Antisuero polivalente somático (O)

·         Antisuero polivalente flagelar (H)

·         Antisuero Vi

MATERIAL

·         Matraces Erlenmeyer de 500 ml

·         Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las muestras simples y compuestas

·         Angulos de vidrio

·         Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas

·         Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm

·         Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm

·         Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 ml, graduadas en 0,1 ml y protegidas con tapón de algodón

·         Pipetas de 1 ml, con graduaciones de 0,01 ml

·         Cajas de petri estériles de vidrio o desechables

·         Rejillas para tubos de ensaye

·         Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro

·         Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones máximas de 0,4 unidades de pH para cambios de color

·         Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:

§  Horno, durante 2 horas a 170-175ºC o autoclave, durante 15 min como mínimo a 121ºC ± 1ºC

 EQUIPO

§  Horno para esterilizar que alcance los 180ºC

§  Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0,1ºC y termómetro

§  Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas

§  Baño maría con termostato y termómetro

§  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g

§  Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio o aluminio)

§  Mecheros Bunsen o Fisher

§  Potenciómetro

 PROCEDIMIENTO

1.     Preparación de los alimentos para el aislamiento de Salmonella

Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. Se recomienda una muestra de 25 g o más.

1.1 Procedimiento general para la preparación de muestras

Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si es necesario durante un min. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa.

Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. Continuar como se indica en 8.2.1.

1.2 Procedimiento específico para la preparación de muestra según el producto
1.2.9 Carnes, sustitutos de carnes, derivados cárnicos, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y hueso).

1.2.9.1 Productos procesados térmicamente y productos secos. Se sigue el procedimiento señalado en 8.1.1 hasta la homogeneización. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse. Después de reposar, mezclar bien y ajustar el pH como se indica en el procedimiento general. Para emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las mismas proporciones y con las mismas recomendaciones que para el coco. La cantidad de los mismos dependerá en gran medida de la composición del alimento. Los detergentes no serán necesarios en los productos glandulares en polvo. Incubar las muestras como se indica en 8.1.1.
1.2.9.2 Productos crudos o altamente contaminados. Pesar porciones de 25 g de producto en dos vasos para licuadora. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y el producto puede pesarse directamente en matraces Erlenmeyer estériles de 500 ml. Adicionar 225 ml de caldo selenito cistina o 225 ml de caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada muestra analítica. Licuar por dos min y pasar asépticamente a matraces Erlenmeyer de 500 ml. Dejar reposar y ajustar el pH

Adicionar 2,25 ml de solución de verde brillante 0,1% y 4,5 ml de solución yodo-yoduro a la muestra que se enriquecerá con caldo tetrationato. Homogeneizar e incubar. Continuar como se indica en 8.2.1.

2.  Aislamiento de Salmonella

2.1 Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport.

2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos.

2.3 Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).

Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.
Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC.

2.4 Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes características:

Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.
 
Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras; con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.

Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.

3. Identificación bioquímica

3.1 Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas.

Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo.

Incubar por 24 ± 2 h a 35ºC.

Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es necesario retomar más colonias.

3.2 Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones:

3.2.1 Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico.

3.2.2 Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.

3.2.3 Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en 8.3.3.

3.3 Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios.
3.4 Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente.

3.5 Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento.

3.6 Prueba de ureasa

3.6.1 Prueba de ureasa (convencional). Con una asa estéril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC.

3.6.2 Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño de agua.

Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color del medio).

4.  IDENTIFICACIÓN SEROLÓGICA

4.1 Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)

4.1.1 Colocar con una asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI.

4.1.2 Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.

4.1.3 Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min. Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.

4.1.4 Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.

La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina.

Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquímicas complementarias.

4.2 Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuentes).

4.2.1 Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.

4.2.2 Si no se cuenta con los sueros grupoespecíficos, solicitar la tipificación de la cepa al Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o al Laboratorio Nacional de Salud Pública.

4.3 Si se requiere, practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H).

4.3.1 Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a 35ºC hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseina e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 ml de solución salina formalizada a 5 ml del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).

4.3.2 Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. Preparar un control de solución salina mezclando 0,5 ml de solución salina formalizada con 0,5 ml del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50ºC. Observar a intervalos de 15 min por espacio de una h. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.


CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

1.     Interpretación de reacciones bioquímicas y serológicas.

CUADRO 1

Reacciones         Reacciones Interpretación

bioquímicas         serológicas

Típica        Antígeno O, Cepas consideradas

       Vi o H positivo          como Salmonella

Típica        Todas las

       reacciones

       negativas

Típica        No probada   Puede ser

                   Salmonella

Reacciones         Antígeno O,

atípicas     Vi o H

       positivo

Reacciones         Todas las      No debe ser

atípicas     reacciones    considerada

       negativas      Salmonella

Nota: Ver apéndice informativo A.

2.     Reacciones bioquímicas y serológicas de Salmonella

CUADRO 2

Prueba o sustrato           Positivo         Negativo        Reacción

Glucosa (TSI)      amarillo         rojo     +

Lisina descarboxilasa   púrpura         amarillo         +

(LIA)

H2S (TSI y LIA)   negro no negro       +

Ureasa      rojo-púrpura  no hay cambio         -

       de color

Caldo de lisina    púrpura         amarillo         +

descarboxilasa

Caldo dulcitol      amarillo o gas          no hay cambio         +b

rojo de fenol                    de color ni gas

Caldo KCN          crecimiento   no hay           -

       crecimiento

Caldo malonato  azul    no hay cambio         -c

       de color

Prueba de indol  superficie color        superficie color        -

       violeta            amarillo

Prueba del antígeno      aglutinación no hay           +

flagelar     aglutinación

Prueba del antígeno      aglutinación no hay           +

somático   aglutinación

Caldo lactosa      amarillo o gas          no hay cambio         -c

rojo fenol  de color ni gas

Caldo sacarosa   amarillo o gas          no hay cambio         -

rojo fenol  de color ni gas

Prueba Voges-    de rosa a rojo           no hay cambio         -

Proskauer            de color

Prueba rojo de metilo    rojo difuso     amarillo difuso         +

Citrato de Simmons       crecimiento   no hay           v

       color azul      crecimiento, no

       hay cambio

       de color

a +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o más negativas en 1 o 2 días; v, variable.

b La mayoría de los cultivos S. arizonae son negativos.

c La mayoría de los cultivos S. arizonae son positivos.

3.    Informe de resultados

Informar: presencia o ausencia de Salmonella en __________ g o ____________ ml de muestra.
Bibliografía:

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